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柯薩奇病毒A24型PCR檢測試劑盒檢測方法

柯薩奇病毒A24型PCR檢測試劑盒檢測方法:​
1.Ⅰ法:
在PCR反應體係中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈後,發射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
定量PCR擴增熒光曲線圖
PCR產物熔解曲線圖
2.TaqMan探針法:
探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測係統可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。
取凍存已裂解的細胞,室溫放置5分鍾使其完全溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang,蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒後,15到30℃孵育2到3分鍾。4℃下12000rpm離心15分鍾。離心後混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相,中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配於水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉澱 將水相上層轉移到一幹淨無RNA酶的離心管中。加等體積yibing醇混合以沉澱其中的RNA,混勻後15到30℃孵育10分鍾後,於4℃下12000rpm 離心10分鍾。此時離心前不可見的RNA沉澱將在管底部和側壁上形成膠狀沉澱塊。
④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%yi醇(75%yi醇用DEPCH2O配製),清洗RNA沉澱。混勻後,4℃下7000rpm離心5分鍾。
⑤RNA幹燥 小心吸去大部分yi醇溶液,使RNA沉澱在室溫空氣中幹燥5-10分鍾。
⑥溶解RNA沉澱 溶解RNA時,先加入無RNA酶的水40μl用槍反複吹打幾次,使其完全溶解,獲得的RNA溶液保存於-80℃待用。 1)紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然後取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)後,讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,測定RNA溶液 濃度和純度。

 

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